sabato 9 novembre 2024

Intervista al Dottore Agronomo Antonio Bruno sulla costituzione di un Consorzio pubblico per il controllo della sputacchina con l’ossido di carlina per limitare la diffusione di Xylella fastidiosa

 


Intervista al Dottore Agronomo Antonio Bruno

Giornalista: Dottor Bruno, oggi parliamo di una ricerca importante condotta dall’Università di Camerino sulla lotta contro la Xylella fastidiosa, un batterio che da tempo minaccia gravemente la coltivazione dell’olivo. Ci può spiegare l’importanza di questa scoperta e quali sono le implicazioni economiche e ambientali?

Dott. Bruno: Certamente. La Xylella fastidiosa è una delle maggiori minacce per l’olivicoltura, specialmente in Italia, dove la produzione di olio d’oliva è un pilastro economico e culturale. La diffusione di questo batterio, veicolato dall'insetto Philaenus spumarius, noto come “sputacchina”, non solo danneggia la salute delle piante ma infligge anche un duro colpo all’economia agricola locale e nazionale. A livello ambientale, la perdita di piante sane altera interi ecosistemi, mettendo a rischio la biodiversità. Il fatto che questa ricerca abbia portato all’identificazione di una molecola di origine naturale come l’ossido di carlina, con potenziale insetticida, rappresenta un grande passo avanti verso un approccio più sostenibile.

Giornalista: La dott.ssa Eleonora Spinozzi ha evidenziato come l’ossido di carlina mostri una promettente attività contro la sputacchina. Quali sono, secondo lei, i vantaggi di utilizzare una molecola naturale in questo contesto?

Dott. Bruno: L’uso di una molecola naturale, come l’ossido di carlina, ha diversi vantaggi rispetto agli insetticidi sintetici. In primo luogo, riduce l’impatto ambientale: i pesticidi sintetici possono accumularsi nel terreno e nelle falde acquifere, con conseguenze dannose per l’ambiente e la salute umana. Inoltre, gli insetti tendono a sviluppare resistenza ai pesticidi chimici, rendendo questi ultimi progressivamente meno efficaci. Una molecola naturale, come quella studiata dal gruppo della dott.ssa Spinozzi, potrebbe ridurre questo rischio di resistenza, poiché gli insetti sono meno adattati a contrastare sostanze di origine naturale.

Giornalista: La ricerca ha anche evidenziato che l’ossido di carlina, una volta incapsulato, possiede un effetto antifeeding e tossicità per ingestione. Qual è il valore di questi risultati?

Dott. Bruno: L’efficacia della molecola, anche a basse dosi, dimostrata attraverso i suoi effetti antifeeding e la tossicità per ingestione, è estremamente significativa. L’effetto antifeeding, in particolare, implica che l’insetto perde l’interesse per la pianta, riducendo così il rischio di trasmissione della Xylella. Questo consente di ridurre l’utilizzo complessivo di trattamenti, limitando l’impatto ecologico e ottimizzando il controllo della sputacchina. Inoltre, il fatto che sia efficace fino a 24 ore dal trattamento è un indicatore promettente per la sostenibilità di un eventuale prodotto insetticida basato su questa molecola.

Giornalista: Secondo lei, quali potrebbero essere le prossime fasi per trasformare questo studio in una soluzione pratica per gli agricoltori?

Dott. Bruno: La ricerca ha già fornito una base solida per futuri sviluppi. Le prossime fasi dovrebbero includere prove in campo su vasta scala per testare l’efficacia e la stabilità della molecola in ambienti aperti, condizioni atmosferiche variabili e nel lungo periodo. Inoltre, sarà essenziale coinvolgere aziende agricole e produttori di fitofarmaci per valutare la fattibilità economica di produzione e commercializzazione di un prodotto a base di ossido di carlina. Se queste fasi avranno successo, potremo finalmente offrire agli agricoltori uno strumento efficace, sostenibile e accessibile per combattere la Xylella.

Giornalista: Ultima domanda, Dottor Bruno. Qual è, secondo lei, l’impatto che ricerche di questo tipo possono avere sull’agricoltura del futuro?

Dott. Bruno: Ricerche come questa stanno tracciando la strada per un’agricoltura più sostenibile e consapevole. Lo sviluppo di molecole naturali per il controllo dei parassiti non solo protegge le colture, ma preserva anche l’ambiente e la salute delle persone. Il futuro dell’agricoltura deve necessariamente orientarsi verso la sostenibilità e la tutela della biodiversità, e questa ricerca rappresenta un esempio perfetto di come la scienza possa essere al servizio dell’agricoltura in modo innovativo e rispettoso dell’ambiente.

Giornalista: Dottor Bruno, considerando i promettenti risultati di questa ricerca, quali potrebbero essere i passaggi necessari per garantire l’uso diffuso di questo insetticida naturale? È possibile immaginare un supporto istituzionale per facilitarne la distribuzione agli agricoltori?

Dott. Bruno: Certamente, il supporto delle istituzioni è cruciale in questa fase. In passato, l’Italia ha già affrontato sfide simili, e lo Stato è intervenuto attivamente per sostenere gli agricoltori. Un esempio emblematico è stato il Consorzio Antifillosserico, un ente istituito per contrastare l’epidemia di fillossera, che minacciava seriamente i vigneti italiani. Questo consorzio aveva il compito di organizzare e distribuire le soluzioni fitosanitarie necessarie e garantire un’azione coordinata sul territorio.

Allo stesso modo, oggi potremmo prevedere la creazione di enti o consorzi specifici per la lotta contro la Xylella, incaricati di produrre e distribuire questo tipo di insetticidi naturali. Un ente di questo tipo potrebbe garantire non solo l’accessibilità e l’efficacia degli interventi, ma anche una gestione sostenibile su larga scala.


Targeting per Xylella fastidiosa : gestione sostenibile di Philaenus spumarius utilizzando l'ossido di carlina

https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2024.119923Ottieni diritti e contenuti
Con licenza Creative Commons
accesso aperto

Punti salienti

  • •
    La bioattività dell'ossido di carlina è stata valutata su Philaenus spumarius .
  • •
    È stata sviluppata una nanoemulsione (NE) di ossido di carlina stabile al 3% (p/p).
  • •
    Sono state osservate risposte elettroantennografiche dimorfiche sessualmente su P. spumarius .
  • •
    L'ossido di carlina ha mostrato attività antifeedant/repellente contro P. spumarius .
  • •
    È stata rilevata tossicità per ingestione dell'ossido di carlina NE negli adulti.

Astratto

Xylella fastidiosa Wells, un batterio patogeno delle piante, rappresenta una minaccia per molte colture in tutto il mondo. Sfortunatamente, non sono disponibili trattamenti efficaci per ridurre l'infezione e, ad oggi, la strategia più promettente si basa sul controllo della sputacchina dei prati Philaenus spumarius L., uno dei principali vettori di X. fastidiosa . Tra insetticidi e repellenti, gli insetticidi botanici rappresentano candidati preziosi. Il loro incapsulamento in formulazioni stabili, come le nanoemulsioni (NE), può aumentarne l'efficacia e la stabilità. Abbiamo studiato la tossicità, l'attività repellente e antifeedant dell'ossido di carlina, un poliacetilene isolato dalle radici di Carlina acaulis L. (Asteraceae), e dei suoi NE, contro gli adulti di P. spumarius . Inoltre, abbiamo eseguito test elettroantennografici (EAG) per valutare la capacità delle antenne maschili e femminili di percepire l'ossido di carlina. I test EAG hanno dimostrato che il sistema olfattivo antennale di P. spumarius di entrambi i sessi è in grado di percepire l'ossido di carlina in un'ampia gamma di dosi e che le femmine, alle dosi più basse, hanno una sensibilità olfattiva significativamente maggiore rispetto ai maschi (rispettivamente 0,01 e 0,1 µg ( p < 0,001)). Negli esperimenti di tossicità, la percentuale di sopravvivenza degli adulti nelle prove topiche e fumiganti era elevata, mentre risultava significativamente inferiore nelle prove di ingestione. Nei test olfattivi, P. spumarius ha mostrato una leggera preferenza per i fagiolini trattati con l'1% di ossido di carlina. Tuttavia, non sono state osservate differenze significative tra i trattamenti quando la concentrazione di ossido di carlina è stata aumentata al 3%. Al contrario, i test di alimentazione hanno mostrato un significativo effetto repellente dell'ossido di carlina contro gli adulti di P. spumarius fino a 24 ore dopo il trattamento e una riduzione della presenza di P. spumarius sui fagiolini trattati che andava dal 51,2% al 94,7%, se confrontati con i fagiolini di controllo. Nel complesso, questo studio getta luce sul possibile sviluppo di formulazioni efficaci e rispettose dell'ambiente di ossido di carlina per gestire P. spumarius . Sono necessari ulteriori studi per valutare l'efficacia di questo composto naturale in condizioni di campo e per indagare i suoi potenziali effetti collaterali su specie non bersaglio.

Parole chiave

Sputacchina dei prati
Afroforidi
Insetticidi botanici
EAG
Tossicità
Antifeedante

1 . Introduzione

Xylella fastidiosa Wells, Raju, Hung, Weisburg, Parl & Beemer (Xanthomonadaceae) è un batterio gram-negativo che comprende numerose sottospecie, diffuso in tutto il mondo in oltre 40 paesi ( EPPO, 2024 ) e trasportato da numerosi insetti vettori ( Cornara et al., 2018 ). In Italia, la prima segnalazione è stata registrata nel Salento, in Puglia, nel 2013 ( Saponari et al., 2013 ) e il batterio è stato identificato per la prima volta grazie alla bruciatura fogliare manifestata su oleandri, mandorli e ulivi. È noto che questo patogeno causa gravi danni diretti alle piante ospiti fino alla loro morte ( Saponari et al., 2017 ). Infatti, ci sono più di 550 specie di piante in tutto il mondo, commerciali e selvatiche, sensibili a questo batterio ( EFSA, 2024 ). A causa dell'elevata gravità dei danni alle piante che provoca e del gran numero di specie ospiti, questo patogeno rappresenta una minaccia per le colture economicamente importanti e per l'ambiente ( Ali et al., 2021 , Schneider et al., 2021 ). Sfortunatamente, non sono disponibili trattamenti contro questo batterio. Tuttavia, strategie di controllo mirate alla popolazione di insetti vettori possono limitare l'accesso dell'insetto alle piante infettive e prevenire la successiva inoculazione del patogeno ( Lago et al., 2022 ). La sputacchina dei prati Philaenus spumarius L. (1758) (ordine Hemiptera, superfamiglia Cercopoidea, famiglia Aphrophoridae) è uno dei principali vettori di X. fastidiosa ( Cornara et al., 2018 ) ed è ampiamente distribuita in tutto il mondo, coprendo la maggior parte delle regioni paleartiche fino al Neartico, soprattutto nelle aree più temperate ( Godefroid et al., 2021 ). Medicago sativa L. (1753), Trifolium spp. L., Vicia spp. L. e Xanthium strumarium L. (1753) sono le principali piante ospiti ( Thompson et al., 2023 ). Tuttavia, la sputacchina dei prati ha un'ampia gamma di ospiti appartenenti a più di 100 famiglie, il che probabilmente rappresenta il motivo per cui questo parassita ha un'elevata distribuzione mondiale ( Cornara et al., 2018 , Santoiemma et al., 2019 ). Questo insetto, come ninfa e adulto, ingerisce un'elevata quantità di linfa xilematica nutrendosi delle parti giovani della pianta e contemporaneamente acquisisce X. fastidiosa , diventando un vettore dannoso. Purcell (1981)hanno affermato che la probabilità di trasmissione del batterio dipende da quattro fattori: l'infettività del vettore, l'efficienza di trasmissione, il numero di vettori e il tempo che trascorrono sull'ospite. Interferire e ridurre il numero di vettori e il tempo che trascorrono sull'ospite rappresentano strategie efficaci per controllare questo insetto e, di conseguenza, il batterio.
In questo contesto, il controllo di P. spumarius si è concentrato sugli insetticidi di sintesi. In particolare, i principali insetticidi efficaci impiegati contro P. spumarius appartengono alle classi dei piretroidi e dei neonicotinoidi. Tuttavia, le recenti restrizioni all'uso dei neonicotinoidi e la scarsa efficacia dei piretroidi insieme all'aumento della resistenza rendono i metodi di controllo disponibili contro questo parassita estremamente deboli ( Lago et al., 2022 ). Pertanto, il controllo di questo insetto altamente polifago richiede una strategia di lotta integrata (IPM). L'uso di strumenti basati su sostanze alternative ed efficaci con attività repellente o tossica, ad esempio quelle basate su derivati ​​botanici, è estremamente incoraggiato per la loro promettente efficacia ( Bedini et al., 2024 , Dongiovanni et al., 2018 ). Nello specifico, l'uso di oli essenziali (EO) o composti derivati ​​botanicamente può contribuire allo sviluppo di strumenti innovativi e approcci alternativi all'uso di pesticidi sintetici ( Ganassi et al., 2020 , Gondwal et al., 2024 , Rizzo et al., 2020 ). Tuttavia, questi prodotti solitamente devono essere formulati per essere distribuiti in modo efficiente e per ridurre l'impatto sulla salute e sull'ambiente ( An et al., 2022 , Bamisaye et al., 2023 , Geng et al., 2017 ). A questo proposito, le nanoemulsioni (NE) svolgono un ruolo cruciale in agricoltura e sono considerate i nanosistemi più promettenti per scopi di controllo dei parassiti date le loro dimensioni nanometriche delle particelle e la semplicità di formulazione e gestione ( Rizzo et al., 2021 ). Di conseguenza, una NE altamente promettente è quella basata sull'ossido di carlina di poliacetilene. Questo composto viene estratto dalle radici della pianta Carlina acaulis L. (Asteraceae), la cui concentrazione supera il 97% della composizione chimica complessiva ed è la causa principale dell'efficacia dell'EO ( Benelli et al., 2021 , Spinozzi et al., 2023 ). L'ossido di Carlina ha mostrato un buon potenziale antimicrobico e antivirale come riportato in studi precedenti ( Rosato et al., 2021 , Saralieva et al., 2022 , Wnorowska et al., 2022 ). Inoltre, l'EO e gli estratti di C. acaulis hanno mostrato una ridotta tossicità su fibroblasti, enterociti ed embrioni di pesce zebra, un effetto limitato su organismi terrestri e acquatici non bersaglio e una bassa tossicità sui ratti per somministrazione orale ( Benelli et al., 2022 , Wnorowska et al., 2024). Sulla base di quanto sopra, il presente studio si è concentrato sulla valutazione dell'ossido di carlina e della sua forma formulata (NE) come tossici, repellenti, attraenti e antifeedanti contro gli adulti di P. spumarius . L'uso del NE è stato valutato nei biotest con tossicità diretta (ingestione, topica e fumigante) per comprendere meglio la stabilità dell'ossido di carlina incapsulato, esposto a fattori esterni (ad esempio contatto con piante e corpi di insetti), in modo che potesse avere una maggiore adattabilità come potenziale bioinsetticida di campo.

2. Materiali e metodi

2.1 . Allevamento in laboratorio delle piante

Le piante di fava ( Vicia faba L. var. 'Reina mora' (Semillas Fitó Italia©)) utilizzate negli esperimenti di ingestione, topici e fumiganti sono state coltivate presso il CREA - Centro di ricerca per la protezione e la certificazione delle piante (CREA-DC), Palermo, Italia. I semi sono stati seminati e coltivati ​​in vasi da 0,5 L (10 ×10 x 10 cm) con torba, terriccio (OmniaVitaflor®, VitaFlor, Italia) e vermiculite espansa (VIC, Italiana®) e sono stati posizionati in una gabbia a maglie fini (90 ×70 x 200 cm) per prevenire infestazioni da parte di specie di insetti indesiderati. La gabbia è stata posizionata a 25 ± 2°C e 50 ± 10% di umidità relativa (UR) e 15:9 (L:D) di fotoperiodo. La fertilizzazione idrica è stata effettuata una volta ogni due settimane con Foliar Gold® (Hydro Fert, Italia) e non sono stati utilizzati pesticidi. Per gli esperimenti e l'allevamento di P. spumarius sono state utilizzate piante alte circa 60 cm e con almeno 7 veri germogli .

2.2 . Allevamento di insetti in laboratorio

La colonia di laboratorio di insetti per esperimenti di ingestione, topici e fumiganti è stata avviata con la raccolta di schiume con giovani stadi di P. spumarius da marzo a giugno nel campo selvaggio della Sicilia orientale (Catania, Italia). La coltura di scorta è stata mantenuta presso il CREA-DC in gabbie schermate con maglie fini (45 ×45 x 45 cm) e collocata in una camera con condizioni controllate di temperatura (24 ± 1°C) e umidità relativa (50 ± 10%) con 16:8 (L:D) di fotoperiodo fino all'emersione degli adulti. Una volta alla settimana, fagiolini e fave fresche sono state sostituite come substrato di alimentazione. Gli adulti coetanei appena emersi sono stati utilizzati per le attività sperimentali.

2.3 . Estrazione dell'ossido di carlina

Le radici secche di Carlina acaulis , ottenute da Minardi & Figli Srl (Bagnacavallo, Ravenna, Italia; https://www.minardierbe.it ; lotto n. C-230223–31), sono state impiegate per l'isolamento dell'ossido di carlina tramite idrodistillazione, secondo una procedura già riportata ( Rizzo et al., 2024 ). Una volta estratto, l'ossido di carlina è stato conservato a - 20°C fino ai biotest. L'ossido di carlina è stato ottenuto con una resa dello 0,82% (p/p) e una purezza del 99,2%, come determinato dall'analisi GC-MS ( Fig. 1 ). La sua struttura è stata confermata dalla combinazione di analisi MS e NMR che erano in linea con quelle precedentemente riportate ( Benelli et al., 2019 ).
Figura 1
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Fig. 1.

2.4 . Preparazione e caratterizzazione delle nanoemulsioni di ossido di carlina testate

L'ossido di carlina è stato incapsulato in NE seguendo la stessa procedura riportata da Tortorici et al. (2024) . La formulazione includeva un agente bagnante (Agrozoofarma Srl), Polisorbato 80, come tensioattivo, e oleato di etile, come cosolvente oleoso, nella quantità richiesta per avere concentrazioni finali rispettivamente dello 0,1, 2 e 1% (p/p). La quantità richiesta di ossido di carlina per raggiungere la concentrazione del 3% (p/p) nelle formulazioni finali è stata solubilizzata in oleato di etile. Successivamente, la fase oleosa è stata emulsionata con una soluzione acquosa di tensioattivo e l'agente bagnante mediante agitazione ad alta velocità (Ultraturrax T25 basic acquistato da IKA® Werke GmbH and Co.KG, Staufen, Germania) a 13.500 giri/min per 5 min. L'emulsione ottenuta è stata elaborata in un estrattore a ultrasuoni da 2 litri U2020 (170 W, 230 V, 50 Hz), acquistato da Albrigi Luigi Srl (Verona, Italia) per 40 min. Il programma ad alta potenza + omogeneizzazione (H + M) è stato selezionato per ridurre la dimensione delle goccioline della fase oleosa. Un NE di controllo è stato preparato sostituendo la quantità di ossido di carlina con acqua e seguendo la stessa procedura. La dimensione delle particelle delle fasi disperse di ossido di carlina al 3% e NE di controllo è stata valutata tramite un dispositivo di diffusione dinamica della luce (Zetasizer nanoS, Malvern Instrument, Malvern, Regno Unito) utilizzando la stessa procedura di Benelli et al. (2020) . Le formulazioni sono state conservate a 4°C al riparo dalla luce in fiale ben chiuse. La stabilità è stata valutata tramite lettura della dimensione media delle goccioline (Z-media) e dell'indice di polidispersione (PDI) per un periodo di 3 mesi.

2.5 . Registrazioni elettroantennografiche (EAG)

La chemiocettività antennale dei maschi e delle femmine di P. spumarius a concentrazioni crescenti di ossido di carlina è stata valutata utilizzando la tecnica EAG descritta in studi precedenti ( Ganassi et al., 2020 , Germinara et al., 2017 ). In breve, la testa degli insetti è stata sezionata e la metà distale dell'arista è stata rimossa. Una pipetta di vetro riempita con soluzione salina di Kaissling ( Kaissling e Thorson, 1980 ) è stata inserita nella base della testa come elettrodo indifferente. La punta dell'arista amputata è stata messa a contatto con l'estremità di una pipetta simile (diametro 0,1 mm) che fungeva da elettrodo di registrazione. Sono stati utilizzati fili d'argento rivestiti di AgCl per mantenere la continuità elettrica tra la preparazione antennale e un amplificatore AC/DC UN-6 in modalità DC collegato a un PC dotato del programma EAG 2.0 (Syntech Laboratories, Hilversum, Paesi Bassi). Gli stimoli sono stati insufflati da una siringa monouso in un flusso costante (500 mL/min) di aria umidificata filtrata con carbone attivo che scorreva in un tubo di erogazione in acciaio inossidabile (diametro di 1 cm) con l'uscita posizionata a circa 1 cm dalla superficie adassiale dell'antenna. Durante l'esperimento, sono stati aggiunti 2,5 cm 3 di vapore da una cartuccia di odori in 1 sec. Gli stimoli erano 10 µL di soluzioni di olio minerale decimale (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) di ossido di carlina presentate a concentrazioni crescenti da 0,001 a 100 µg/µL che fornivano rispettivamente la dose di 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100, 1000 µg. Controllo (10 μL di olio minerale) e stimoli standard (10 μL di una soluzione di 1 μg/μL di ( Z )-3-esenolo) sono stati applicati all'inizio dell'esperimento e dopo ogni 3 soluzioni di test di ossido di carlina. C'era un intervallo di 30 s tra gli stimoli. Le risposte EAG sono state registrate da 5 antenne di maschi e femmine diversi.

2.6 Biotest di risposta comportamentale a due scelte

Le risposte olfattive degli adulti di P. spumarius all'ossido di carlina sono state valutate nell'olfattometro ad aria ferma descritto da Carpita et al. (2012) . Una camera conteneva un segmento di fagiolino verde biologico (Almaverde bio Italia Srl Cesena, Italia) (1 cm) trattato con n -esano (controllo) e l'altra camera conteneva un segmento simile di fagiolino verde trattato con ossido di carlina. Le concentrazioni di ossido di carlina testate erano 1 e 3%. I fagioli sono stati immersi per 1 s in una soluzione di ossido di carlina disciolto in n -esano o solo n -esano e lasciati asciugare per 1 min. Per ogni test, i fagioli (trattati e non trattati) sono stati posizionati nelle camere laterali dell'olfattometro e un adulto di P. spumarius non sessato è stato delicatamente posizionato sul pavimento della camera di rilascio utilizzando delle pinzette. Quindi, la parte superiore dell'arena è stata chiusa. La scelta è stata considerata valida quando P. spumarius è entrato in una delle camere successive dopo almeno 20 s ed è rimasto in essa per almeno 30 s. Il tempo di osservazione totale è stato di 360 s. Gli insetti che non sono stati in grado di scegliere dopo 360 s sono stati scartati. Ogni P. spumarius è stato testato solo una volta. Per ogni concentrazione di ossido di carlina, sono stati testati 40-60 adulti di P. spumarius raccolti sul campo senza sesso . Il test è stato replicato fino a ottenere almeno 30 scelte valide. Tutti gli esperimenti sono stati condotti a 25 ± 2 °C e 65 % RH e illuminati solo con un tubo fluorescente a luce diurna (Philips 30 W/33, 10.000 lux) posizionato sopra l'arena. Dopo ogni insetto testato, l'arena è stata ruotata di 90° in senso orario per evitare distorsioni posizionali e i fagiolini sono stati rinnovati. Dopo quattro test consecutivi, l'arena e i pannelli di vetro sono stati puliti con esano, lavati con acqua calda e sapone neutro, risciacquati prima con acqua calda per circa 30 s, poi con acqua distillata e, infine, asciugati. Dopo la valutazione, ogni esemplare di insetto è stato posto in fiale individuali, conservato a - 20 °C e successivamente sessato.

2.7 . Biotest antifeeding

Il biotest antifeeding è stato eseguito in gabbie di rete di nylon di 47,5 cm × 47,5 cm × 93 cm (BugDorm-4M4590 Insect Rearing Cage, MegaView Science Co., Ltd., Taiwan). Un mazzo di dieci fagiolini è stato posizionato in ciascuno dei quattro angoli della gabbia a circa 10 cm dal bordo. Le tazze (due tazze con fagiolini trattati e due con fagiolini non trattati) sono state posizionate negli angoli, alternando tazze con fagiolini trattati e non trattati. I fagiolini sono stati posizionati in tazze contenenti cotone idrofilo imbevuto d'acqua. La superficie dei fagiolini è stata trattata mediante immersione in una soluzione di etanolo di ossido di carlina al 3% (trattata) o solo etanolo (controllo). Le gabbie sono state disposte sotto lampade fluorescenti, per fornire un'illuminazione uniforme (intensità luminosa di circa 14 lux nelle gabbie) e sono state mantenute a 23 °C e circa il 65% di umidità relativa. Per mantenere l'umidità all'interno della gabbia, è stato posizionato in ogni gabbia un becher (500 mL) contenente cotone imbevuto d'acqua. L'esperimento è stato replicato cinque volte. In ogni gabbia sono stati posizionati 40-60 adulti senza sesso (a seconda delle catture sul campo). Nello specifico, il numero di insetti era 40, 60, 55, 40 e 44 per le gabbie 1, 2, 3, 4 e 5, rispettivamente. Il numero di esemplari di insetti sui fagiolini trattati e non trattati è stato registrato dopo 1, 6, 12 e 24 ore. Il diverso numero di esemplari nella gabbia è stato normalizzato esprimendo il numero di insetti sui fagiolini trattati e non trattati come percentuale del numero totale di insetti in ogni gabbia dopo aver verificato l'effetto della dimensione della popolazione ( F 2,30 = 2,067, p = 0,342).

2.8 . Biotest di tossicità da ingestione

È stato eseguito un test di tossicità per ingestione per valutare l'effetto tossico dell'ossido di carlina NE sugli adulti di P. spumarius . Germogli di fava sani sono stati immersi per 3 s nell'ossido di carlina al 3% e lasciati essiccare in condizioni di laboratorio per 30 min. La stessa procedura è stata eseguita per il controllo negativo (acqua distillata) e per il controllo NE senza ossido di carlina. I germogli trattati sono stati inseriti in un Eppendorf da 2 mL con acqua distillata e sigillati con Parafilm® (Bemis™) per evitare la disidratazione. Nell'arena sperimentale, composta da una scatola di plastica ventilata (175 ×120 x 70 mm) e dai germogli trattati, è stato inserito un singolo adulto di P. spumarius non sessato con un aspiratore orale. Le arene sperimentali erano in una camera climatica con condizioni ambientali controllate di 24 ± 1°C, 50 ± 10% di umidità relativa (RH) e con 16:8 (L:D) di fotoperiodo. La sopravvivenza degli adulti (%) è stata controllata a 24, 48 e 72 ore dal rilascio degli insetti. Per ogni trattamento sono state eseguite 30 repliche (scatole), per un numero totale di 30  adulti di P. spumarius .

2.9 . Biotest di tossicità topica

L'effetto tossico dell'ossido di carlina NE è stato valutato anche tramite trattamento topico su P. spumarius . Gli adulti non trattati sono stati raccolti dall'allevamento in laboratorio e posti a - 4°C per 80 s. Una quantità totale di 0,2 μL di NE al 3% è stata rilasciata sul pronoto dell'insetto con una micropipetta ed è stata lasciata asciugare per 30 min. Lo stesso trattamento è stato eseguito con il controllo negativo e il controllo NE senza ossido di carlina. Successivamente, gli insetti trattati sono stati spostati con un aspiratore orale e posizionati su germogli di fava disposti nella scatola di plastica ventilata come descritto sopra. Le arene sperimentali erano in una camera climatica con condizioni ambientali controllate di 24±1°C, 50±10% RH e con 16:8 (L:D) di fotoperiodo. La sopravvivenza degli adulti (%) è stata registrata a 24, 48 e 72 ore dopo il rilascio. Per ogni trattamento sono state eseguite tre repliche (scatole), per un numero totale di 30  adulti di P. spumarius .

2.10 . Biotest dell'attività fumigante

L'effetto fumigante dell'ossido di carlina NE è stato valutato su adulti di P. spumarius . NE al 3% (216 μL) è stato rilasciato su un quadrato di carta da filtro (2 × 2 cm) (carta da filtro qualitativa Whatman®, grado 1) e lasciato asciugare per 2 ore. La stessa procedura è stata seguita per il controllo negativo e il controllo NE senza ossido di carlina. L'arena sperimentale, come descritto sopra, era una scatola di plastica sigillata (175 × 120 × 70 mm) in cui la carta da filtro trattata è stata posizionata all'interno di una capsula di Petri aerata chiusa, incollata al fondo della scatola di plastica, per evitare il contatto diretto con l'insetto. All'interno della scatola sono stati posizionati un germoglio di fava e un singolo adulto di P. spumarius non sessato . La sopravvivenza degli adulti (%) è stata controllata ogni 24, 48 e 72 ore dopo il rilascio. Le arene sperimentali erano in una camera climatica con condizioni ambientali controllate di 24±1°C, 50±10% RH e con 16:8 (L:D) di fotoperiodo. Per ogni trattamento sono state eseguite 30 repliche (scatole), per un numero totale di 30  adulti di P. spumarius .

2.11 . Analisi dei dati

Le risposte EAG sono state valutate misurando l'ampiezza massima della deflessione di polarità negativa (-mV) provocata da uno stimolo ( Germinara et al., 2019 ). Il valore assoluto dell'ampiezza EAG (mV) per ogni stimolo di prova è stato regolato per compensare gli artefatti del solvente e/o meccanosensoriali sottraendo la risposta EAG media dei due controlli di olio minerale più vicini ( Pistillo et al.,. 2022 ). L'ampiezza EAG risultante è stata corretta in base alla riduzione della risposta EAG allo standard, per compensare la diminuzione della sensibilità antennale durante l'esperimento (Den Otter et al., 1991 ).
Le risposte EAG corrette a ciascuna concentrazione di ossido di carlina sono state confrontate con un valore basale di "0" utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon e considerate misurabili se significative a p = 0,05. Per ciascuna concentrazione di ossido di carlina, le risposte EAG medie maschili e femminili sono state confrontate utilizzando il test t di Student per campioni indipendenti. Negli esperimenti dose-risposta, la prima dose a cui la risposta EAG media era superiore a un valore "0" utilizzando il test di Shapiro Wilk per la normalità seguito dal test t di Student a un campione ( p = 0,05) è stata considerata come soglia di attivazione ( Germinara et al., 2017 ); la soglia di saturazione è stata definita come la dose più bassa a cui la risposta media era uguale o inferiore alla dose precedente ( Germinara et al., 2016 ).
Nel biotest di risposta comportamentale a due scelte, la percentuale di individui che hanno scelto la camera trattata con ossido di carlina è stata confrontata utilizzando un test di verosimiglianza del chi quadrato, presupponendo un'ipotesi nulla di una probabilità del 50:50 che gli insetti scegliessero la camera di controllo rispetto a quella trattata con ossido di carlina.
I dati del biotest antifeeding sono stati analizzati tramite un'ANOVA a misurazione ripetuta (RM-ANOVA). L'analisi mirava a valutare le differenze nell'abbondanza di P. spumarius che si alimentava su fagiolini trattati con l'ossido di carlina e quelli che si alimentavano su fagiolini di controllo, con il tempo come misura ripetuta, il trattamento (trattato o non trattato) come fattore tra soggetti e la percentuale di insetti su fagiolini trattati e non trattati come variabile dipendente. È stata applicata la correzione Greenhouse-Geisser per la sfericità. Le differenze tra le medie marginali stimate per i fagiolini trattati e di controllo sono state testate utilizzando la procedura di confronto a coppie di Bonferroni. Per ogni momento di osservazione, le differenze tra i trattamenti sono state verificate tramite il test t di Student.
I dati derivanti da ingestione, tossicità topica e fumigante sono stati controllati tramite il test di Levene per omogeneità e normalità delle variabili dipendenti, ove necessario. I dati sono stati valutati tramite GLM univariato seguito dai test post hoc HSD di Tukey, ove opportuno ( p ≤ 0,05) per confronti di medie multiple tra i trattamenti.
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software SPSS 25.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).

3 . Risultati

3.1 . Caratterizzazione della nanoemulsione di ossido di carlina testata

Le misurazioni DLS dell'ossido di carlina NE hanno rivelato che la dimensione media Z delle goccioline di olio rientrava nell'intervallo nanometrico. In particolare, le nanogocce hanno mostrato una distribuzione dimensionale centrata a 157,7± 4,4 nm ( Fig. 2 ).
Figura 2
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Fig. 2. Distribuzione granulometrica (intensità, %) di ossido di carlina al 3% (p/p) e nanoemulsioni di controllo (NE), ottenute tramite diffusione dinamica della luce (DLS).

I valori medi della dimensione media Z e del PDI ottenuti dalle misurazioni DLS del 3% (p/p) di ossido di carlina NE in diversi punti temporali sono stati riportati nella Fig. 3. Il grado di polidispersità è stato determinato controllando il PDI ed è stato ottenuto un valore di 0,22 ± 0,01. La stabilità fisica della formulazione è stata determinata monitorando la loro dimensione media Z e il PDI a 0 (T 0 ), 15 (T 1 ), 30 (T 2 ), 60 (T 3 ) e 90 (T 4 ) giorni di conservazione. La media Z del 3% (p/p) di ossido di carlina NE è rimasta quasi simile nei primi 2 mesi di conservazione (circa 160 nm) ed è leggermente aumentata di soli 20 nm nel punto temporale T 4 (182,3 ± 1,14 nm) ( Fig. 3 a). Per quanto riguarda il PDI, i valori ottenuti in diversi punti temporali sono rimasti pressoché invariati per la formulazione, a dimostrazione della sua stabilità fisica per almeno 3 mesi ( Fig. 3 b).
Figura 3
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Fig. 3. Media Z e PDI della nanoemulsione di ossido di carlina al 3% (p/p) ottenuta tramite diffusione dinamica della luce (DLS) a 0 (T0), 15 (T1), 30 (T2), 60 (T3) e 90 (T4) giorni di conservazione.

3.2 . Registrazioni EAG

Le risposte EAG dei maschi e delle femmine di P. spumarius a concentrazioni crescenti di ossido di carlina sono illustrate nella Fig. 4. Tutte le concentrazioni hanno provocato risposte EAG misurabili in entrambi i sessi ( p < 0,05 in tutti i test Wilcoxon rank sum). Nell'intervallo di dose testato, la risposta EAG media variava da 0,004 ± 0,001–0,672 ± 0,032 mV nei maschi e da 0,064 ± 0,009–0,632 ± 0,0729 mV nelle femmine. La risposta EAG media delle femmine è stata significativamente più alta di quella dei maschi a dosi di 0,01 ( t = 6,794; df = 8; p < 0,001), 0,1 ( t = 14,994; df = 8; p < 0,001), 10 ( t = 2,655; df = 8; p < 0,029) e 100 μg ( t = 2,772; df = 8; p < 0,024) di ossido di carlina.
Figura 4
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Fig. 4. Curve dose-risposta EAG (media ± SE) di maschio e femmina della sputacchina dei prati Philaenus spumarius a dosi crescenti di ossido di carlina. n = numero di insetti testati. Gli asterischi indicano differenze significative tra i sessi. *, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01 secondo il test t di Student .

Nelle curve dose-risposta, la soglia di attivazione antennale era di 0,01 μg nelle femmine e di 1 μg nei maschi. Le risposte EAG dei maschi e delle femmine alla dose più alta testata (1000 μg) erano più alte di quelle alla dose precedente (100 μg), indicando che la saturazione dei recettori olfattivi antennali non era stata raggiunta nell'intervallo di dosi testate.

3.3 . Biotest di risposta comportamentale a due scelte

Alla concentrazione dell'1% i fagiolini trattati con ossido di carlina erano leggermente più attraenti di quelli non trattati ( χ 2 = 3,920, p = 0,048). Analizzando separatamente le risposte dei maschi e delle femmine, sembra che l'attività attrattiva sia stata esercitata principalmente verso le femmine ( χ 2 = 4,122; p = 0,042) piuttosto che verso i maschi ( χ 2 = 0,000; p = 1,000). Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra i trattamenti al 3% di concentrazione di ossido di carlina ( χ 2 = 0,133; p = 0,715) ( Fig. 5 ).
Figura 5
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Fig. 5. Risposte comportamentali degli adulti di Philaenus spumarius , sputacchina dei prati , esposti a fagiolini trattati o non trattati con ossido di carlina (1 e 3%) nei test olfattomerici a due scelte. Barre grigio chiaro: numero di insetti che hanno scelto la camera di controllo; barre grigio scuro: numero di insetti che hanno scelto la camera dei fagioli trattati con ossido di carlina (test del chi-quadrato, p < 0,05). n = numero di insetti testati.

3.4 . Biotest antifeeding

L'RM-ANOVA ha indicato un effetto significativo del tempo (1, 6, 12 e 24 ore) sul numero di insetti che si nutrono di fagiolini trattati o di controllo ( F 2,15,6 = 7,360, p = 0,004) e un significativo effetto antifeeding del trattamento con ossido di carlina ( F 1,8 = 309,435, p < 0,001), con medie marginali stimate del 4,2 e del 25,6% di insetti che si nutrono rispettivamente di fagiolini trattati e non trattati (confronto a coppie di Bonferroni, p < 0,001) ( Fig. 6 ).
Figura 6
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Fig. 6. Percentuale di adulti di Philaenus spumarius che si nutrono di fagiolini non trattati (grigio chiaro) e trattati con carlina oxide (3%) (grigio scuro) dopo 1, 6, 12 e 24 ore, n = 40–60 sputacchine (vedere Materiali e metodi per i dettagli). Gli asterischi indicano differenze significative tra i trattamenti per ogni volta. **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001 secondo il t-test di Student.

3.5 . Biotest di tossicità per ingestione

L'ossido di carlina NE al 3% ha dimostrato un effetto tossico dopo 72 ore ( F 2,30 = 42,695, p < 0,001) in un esperimento di tossicità da ingestione ( Fig. 7 ). Un'elevata mortalità degli adulti è stata osservata solo nel trattamento con ossido di carlina NE.
Figura 7
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Fig. 7. Sopravvivenza degli adulti di Philaenus spumarius (%) in biotest di tossicità da ingestione dopo 72 ore di test con nanoemulsione di ossido di carlina al 3% (NE). n = numero di insetti testati. Le barre verticali indicano SE. Lettere diverse indicano differenze significative a p < 0,05 (GLM univariato, HSD di Tukey post hoc).

3.6 Biotest di tossicità topica

I risultati della tossicità topica hanno indicato che l'ossido di carlina al 3% NE era scarsamente efficace fino a 72 ore dopo il trattamento se confrontato con i controlli positivi e negativi ( F 2,30 = 2,071, p = 0,132) ( Fig. 8 ). Non è stata registrata alcuna riduzione significativa della sopravvivenza degli adulti dopo 72 ore.
Figura 8
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Fig. 8. Sopravvivenza degli adulti di Philaenus spumarius (%) in biotest di tossicità topica dopo 72 ore di test con nanoemulsione di ossido di carlina al 3% (NE). n = numero di insetti testati. ns = non significativo (GLM univariato). Le barre verticali indicano SE.

3.7 Biotest di tossicità dei fumiganti

I risultati della tossicità del fumigante hanno indicato che l'ossido di carlina al 3% NE era scarsamente efficace fino a 72 ore dopo il trattamento se confrontato con i controlli positivi e negativi ( F 2,30 = 1,218, p = 0,301) ( Fig. 9 ). Non è stata registrata alcuna riduzione significativa nella sopravvivenza degli adulti dopo 72 ore.
Figura 9
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Fig. 9. Sopravvivenza degli adulti di Philaenus spumarius (%) in biotest di tossicità dei fumiganti dopo 72 ore di test con nanoemulsione di ossido di carlina al 3% (NE). n = numero di insetti testati. ns = non significativo (GLM univariato). Le barre verticali indicano SE.

4 . Discussion

Le nanoemulsioni rappresentano una delle strategie di incapsulamento più esplorate per incorporare oli essenziali e composti naturali nelle formulazioni insetticide ( Badawy et al., 2022 , Jesser et al., 2020 , Sharma et al., 2020 ). In effetti, l'efficacia degli EO NE è stata valutata su molti parassiti di prodotti agricoli e immagazzinati, come Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae) ( Tortorici et al., 2024 ), Xilosandrus compactus (Eichhoff) (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) ( Gugliuzzo et al., 2023 ), Oryzaephilus surinamensis (Linnaeus) (Coleoptera: Silvanidae) ( Gharsan et al., 2022 ), Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) ( Louni et al., 2018 ) e Aphis gossypii Glover (Homoptera: Aphididae) ( Heydari et al., 2020 ) con risultati incoraggianti. Gli EO NE garantiscono una stabilità duratura e un'efficienza migliorata superando il collo di bottiglia di questi prodotti come la volatilità dell'EO e la scarsa solubilità in acqua, oltre a favorire la diffusione e l'adesività delle foglie delle colture ( Pavoni et al., 2020 ). L'ossido di carlina è stato precedentemente incapsulato in NE attraverso due diversi metodi ad alta energia, ovvero omogeneizzazione ad alta pressione e sonicazione ( Benelli et al., 2020 , Kavallieratos et al., 2022 , Ntalli et al., 2023 , Pavela et al., 2021 , Tortorici et al., 2024 ). Entrambe le metodologie hanno dimostrato di essere adatte per ottenere l'incapsulamento di questi composti e per ottenere una dimensione delle particelle della fase dispersa nell'intervallo nanometrico. In questo caso, gli ultrasuoni sono stati selezionati per favorire la riduzione della dimensione delle goccioline d'olio dell'ossido di carlina NE e del NE di controllo. Infatti, questa metodologia solitamente garantisce una maggiore stabilità e dimensioni più piccole delle goccioline e richiede un apporto energetico inferiore rispetto ad altri metodi ad alta energia, come l'omogeneizzazione ad alta pressione e la microfluidificazione ( Kumar et al., 2019 ). Tortorici et al. (2024) hanno sviluppato con successo NE di ossido di carlina allo 0,25 e allo 0,50% w/w utilizzando ultrasuoni. La maggiore concentrazione dell'ingrediente principale impiegato in questo studio non ha influenzato la formazione e la stabilità del NE. Inoltre, in questo caso, è stato incluso un agente bagnante per favorire l'adesione della formulazione sulle foglie. Nessuno di questi ingredienti ha influenzato negativamente la formazione e la stabilità dei NE. Infatti, i valori ottenuti per Z-average e PDI del NE di ossido di carlina al 3% sono rimasti stabili nel tempo per un periodo di almeno tre mesi.
Questi eccellenti risultati ottenuti in termini di distribuzione dimensionale delle particelle e stabilità duratura del NE ci hanno permesso di valutare il suo effetto su P. spumarius in termini di tossicità diretta per ridurre la popolazione di insetti e in termini di repellenza/attrattiva. In questo contesto, il biotest EAG ha mostrato che sia i sistemi olfattivi periferici maschili che femminili sono in grado di percepire l'ossido di carlina in un'ampia gamma di dosi, supportando la possibilità che il composto possa agire come segnale a lunga distanza per gli adulti di P. spumarius . Inoltre, è stata riscontrata una marcata maggiore sensibilità delle femmine rispetto ai maschi principalmente alle dosi più basse testate. Risposte EAG sessualmente dimorfiche in P. spumarius sono state segnalate anche in uno studio precedente ( Germinara et al., 2017 ) e ciò potrebbe essere dovuto a differenze fisiologiche quantitative e/o qualitative nell'olfatto ( Raguso et al., 1996 ). Ciò riflette probabilmente differenze nel ruolo svolto dagli stessi composti organici volatili (VOC) nell'ecologia di maschi e femmine. Ganassi et al. (2020) hanno valutato le risposte olfattive degli adulti di P. spumarius verso diversi EO e piante correlate sia a distanza ravvicinata (tubo a Y) che a lunga distanza (galleria del vento), osservando differenze tra maschi e femmine alla stessa fonte di odore. Inoltre, i test a due scelte nell'olfattometro ad aria statica hanno mostrato che, a distanza ravvicinata, la risposta comportamentale di P. spumarius sembra dipendere dalla concentrazione con una risposta diversa tra i sessi. Secondo Ganassi et al. (2020) , nel nostro biotest di risposta comportamentale a due scelte, l'ossido di carlina all'1% ha mostrato un'attività piuttosto attraente che sembra essere dovuta a una risposta differenziale della popolazione femminile ma non di quella maschile. Ciò concorda con i risultati del biotest EAG che ha mostrato una maggiore sensibilità delle femmine rispetto ai maschi. Al contrario, al 3%, non è stata osservata alcuna repellenza o attrattività. La mancanza di un effetto chiaro alla concentrazione più elevata potrebbe essere dovuta alla saturazione dell'ambiente confinato dell'olfattometro da parte dell'ossido di carlina, con conseguente percezione confusa del segnale da parte dell'insetto. L'effetto attrattivo dell'ossido di carlina osservato nel biotest di risposta comportamentale a due scelte era, tuttavia, in contrasto con i risultati dell'esperimento antifeeding. In un ambiente più aperto delle gabbie, la presenza di P. spumarius sui fagiolini è stata significativamente ridotta dal trattamento con ossido di carlina (3%) fino a 24 ore. Qui abbiamo osservato un chiaro effetto repellente dell'ossido di carlina contro gli adulti di P. spumarius , con repellenza che rimaneva significativa fino a 24 ore e che determinava una riduzione della presenza di P. spumariussui fagiolini. I diversi effetti osservati nei due esperimenti possono essere dovuti ai diversi sistemi sperimentali utilizzati e/o alle diverse composizioni chimiche dei botanici testati. I risultati ottenuti nei biotest di tossicità per ingestione, trattamenti topici e fumiganti, con un effetto tossico significativo solo nelle prove di ingestione, hanno mostrato che la modalità di azione dell'ossido di carlina nei confronti degli adulti di P. spumarius è diversa a seconda del trattamento. Infatti, il trattamento per ingestione sembra essere il più efficace probabilmente a causa della capacità dell'ossido di carlina di affondare nella cuticola fogliare e di entrare nei vasi linfatici ( Tortorici et al., 2024 ). Pertanto, l'elevata mortalità di P. spumarius potrebbe essere dovuta alla sua attività succhiante ( Horsfield, 1978 ). Sfortunatamente, il meccanismo d'azione dell'ossido di carlina non è ancora noto, anche se sono state avanzate alcune ipotesi. Ad esempio, Kavallieratos et al. (2022) hanno ipotizzato la capacità dell'ossido di carlina di danneggiare le cellule degli insetti formando carbocationi. Inoltre, Spinozzi et al. (2023) hanno suggerito che l'ossido di carlina potrebbe contribuire come inibitore dell'acetilcolinesterasi, dei recettori dell'octopamina e dei citocromi P450. D'altro canto, i risultati ottenuti nella tossicità topica e fumigante non hanno mostrato differenze significative nella mortalità degli adulti. Allo stesso modo, Tortorici et al. (2024) non hanno osservato alcuna efficacia significativa del composto nel trattamento topico verso le larve di T. absoluta . Pertanto, il nostro studio conferma che l'ossido di carlina non agisce come insetticida topico. Probabilmente ciò potrebbe essere dovuto alla sua scarsa capacità di penetrare nell'esoscheletro degli insetti ( Tortorici et al., 2022 ). Inoltre, la scarsa efficacia dell'ossido di carlina NE nel test fumigante potrebbe essere dovuta al basso effetto soffocante del poliacetilene. Probabilmente l'incapsulamento dell'ossido di carlina in una nanoemulsione ne ha ridotto la volatilità, determinando quindi anche una minore intensità della fonte odorosa e di conseguenza un effetto fumigante fallito. Potrebbe anche dipendere dalla concentrazione di ossido di carlina nel NE. Probabilmente concentrazioni più elevate potrebbero determinare un effetto fumigante più elevato. In future ricerche, valutare l'interferenza dell'ossido di carlina con la trasmissione di X. fastidiosa da parte di P. spumarius dopo il trattamento sarebbe anch'esso di cruciale importanza. In conclusione, l'ossido di carlina potrebbe rappresentare un utile ingrediente botanico per lo sviluppo di nuovi sistemi di controllo sostenibili e alternativi da utilizzare nelle strategie IPM volte a ridurre la diffusione di X. fastidiosa controllando P. spumarius .

Fonti di finanziamento

Questa ricerca è stata finanziata dal progetto COVEXY “Contenimento insetti vettori di Xylella fastidiosa con metodi a basso impatto ambientale” (DM 664980, 29.12.2022) supportato dal Ministero delle Politiche Agricole Alimentari, Sovrane e Forestali ( MASAF ), e dal progetto PRIN 2022 “Bioformulazioni per il rilascio controllato di pesticidi botanici per un’agricoltura sostenibile” (Prot. 202274BK9L) supportato dal Ministero dell’Università e della Ricerca ( MUR ).

Dichiarazione di contributo di paternità del CRediT

Salvatore Giacinto Germinara: Scrittura – revisione e editing, Metodologia, Indagine. Stefano Bedini: Metodologia, Indagine. Angelo Canale: Scrittura – revisione e editing. Simona Tortorici: Scrittura – bozza originale, Metodologia, Data curation. Roberto Rizzo: Scrittura – revisione e editing, Scrittura – bozza originale, Supervisione, Acquisizione finanziamenti. Marco Onofrio Pistillo: Scrittura – bozza originale, Metodologia, Indagine. Giovanni Benelli: Scrittura – revisione e editing, Supervisione. Anita Casadei: Metodologia, Indagine. Filippo Maggi: Scrittura – revisione e editing, Supervisione. Marta Ferrati: Scrittura – bozza originale, Metodologia, Data curation. Diego Romano Perinelli: Metodologia, Data curation. Eleonora Spinozzi: Scrittura – bozza originale, Metodologia, Indagine. Ilaria D'Isita: Metodologia, Data curation. Fabrizio Lapenda: Metodologia, Indagine, Data curation. Giulia Bonacucina: Scrittura – revisione e editing. Riccardo Petrelli: Scrittura – bozza originale.

Dichiarazione di conflitti di interesse

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o relazioni personali note che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato nel presente articolo.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare la ditta Minardi & Figli Srl per aver fornito la materia prima per l'estrazione dell'ossido di carlina e Livia De Fazi per la sua gentile consulenza statistica.

Disponibilità dei dati

I dati saranno resi disponibili su richiesta.

Riferimenti

 

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